NGS 次世代定序：實驗設計到分析的完整思路

為什麼實驗設計先於定序

很多人把 NGS 的難點放在後端分析，但其實實驗設計的決策決定了分析能做到什麼。

核心問題只有三個：

你要問什麼問題？（SNP？基因表達？染色質開放性？）
你需要多少讀段？（覆蓋深度估算）
你需要多長的讀段？（paired-end 150bp 還是 long-read？）

定序深度估算

Whole Genome Sequencing (WGS)

人類基因組 ~3 Gb，一般 SNP calling 建議至少 30×：

需要的 reads = (3 × 10⁹ bp × 30) / 150 bp
             ≈ 6 × 10⁸ reads
             ≈ 600M reads / 樣本

RNA-Seq

基因表達分析的深度取決於轉錄本複雜度：

目的	建議深度
常見基因差異表達	20M reads
低豐度轉錄本	50–100M reads
全轉錄組結構分析	200M+ reads

本站的 NGS 計算機整合了這些估算公式，可以互動輸入參數。

QC 指標解讀

Fastqc 輸出的幾個關鍵指標：

Per-base sequence quality：Q30 > 80% 為可接受標準。
Adapter content：若尾端有 adapter，需要 Trimmomatic 或 fastp 修剪。
GC content：與物種參考範圍偏差 > 10% 時，需警惕污染或文庫偏差。

變異偵測流程 (Variant Calling)

FASTQ → BWA-MEM → SAM/BAM → GATK HaplotypeCaller → VCF → 篩選與注釋
                      ↓
              Samtools sort + index
              Picard MarkDuplicates
              BQSR (Base Quality Score Recalibration)

每一步的輸出都需要 QC check，不能直接傳入下一步。尤其是 duplicate rate > 30% 時，需要重新評估文庫製備。

小結

NGS 不是「把樣本送去定序，等結果回來」這麼簡單的事。前期設計決策、中期 QC 把關、後期分析策略，三個環節缺一不可。

更多互動工具可以在本站 NGS 頁面找到。